Involvement of tumor suppressors, TET2 and TP53, in the evolution and treatment of Chronic Myelomonocytic Leukemia
L'implication des suppresseurs de tumeur, TET2 et TP53, dans l'évolution et le traitement de la Leucémie myélomonocytaire Chronique
Résumé
Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a clonal pathology of the hematopoietic stem cell that presents both myeloproliferative and myelodysplastic characteristics. It is defined by persistent monocytosis greater than 0.5 G/L representing more than 10% of white blood cells. It is a rare disease of elderly people (median 72 years) with a survival of 2 to 3 years. The 3 most frequently mutated genes are TET2 (60%), SRSF2 (50%) and ASXL1 (40%). Mutations in RAS pathway genes (NRAS, KRAS, CBL), identified in 30% of patients, are associated with proliferative forms.My thesis project focuses on the role of tumor suppressors TET2 and TP53 in CMML. In this pathology, TET2 is frequently mutated while TP53 mutations are very rare. The first part of my thesis highlights an over-expression of MIF (Macrophage migration inhibitory factor) in monocytes with truncating mutations of TET2 in CMML patients. We have shown in different models that MIF is over-expressed when TET2 is less expressed. ChIP-PCR experiments showed that TET2 binds directly to the transcription start site (TSS) of MIF. In monocytes with TET2 truncating mutations, decreased recruitment of HDAC1 and HDAC2 to the MIF promoter was identified. This modification of the chromatin structure promotes the transcription of MIF via the transcription factor EGR1 (Early Growth Response Protein 1). I demonstrated by co-immunoprecipitation an interaction between EGR1 and TET2. Finally, MIF is sufficient by itself to induce a bias toward monocytic differentiation during granulomonocytic differentiation of cord blood hematopoietic stem cells (HSCs).Unlike TET2, TP53 is very rarely mutated in CMML. The expression of the TP53 transcript and protein is very heterogeneous in the monocytes of CMML patients. I highlighted a subgroup of patients with a decrease in the expression of TP53 and the corresponding protein. RNA sequencing (RNAseq) analyzes suggest that patients with reduced TP53 expression are more likely to progress to acute myeloid leukemia (AML). Monocytes from CMML patients weakly expressing TP53 also have decreased CSF1R expression, suggesting a maturation defect. Experiments with sh-SCRB and sh-TP53 in HSCs during monocytopoiesis in the presence of CSF1 demonstrated a block of differentiation at a pre-monocytic stage when TP53 is less expressed, showing a role for TP53 in monocyte terminal maturation. We implemented flow cytometry analyzes to study the final step of monocyte maturation by adding the surface molecule CD300E. Our data indicate that patients with low TP53 expression have lower expression of the monocyte surface marker CD300E and are more immature. This terminal maturation defect, when TP53 is less expressed, has also been validated at the single-cell level.By investigating the mechanisms involved in TP53 underexpression, we identified a correlation between TP53 and EGR1 in monocytes from CMML patients. Decreasing EGR1 expression by siRNA decreases TP53 expression in patient monocytes. Finally, using the DACOTA cohort, we demonstrated that patients expressing low TP53 had poorer survival when treated with hydroxyurea.My work highlights an interest in patient stratification and suggests therapeutic approaches to restore the expression of TP53 in the leukemic clone to reduce the risk of transformation of chronic disease into acute leukemia.
La Leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une pathologie clonale de la cellule souche hématopoïétique qui présente des caractéristiques à la fois myéloproliférative et myélodysplasique. Elle est définie par une monocytose persistante supérieure à 0.5 G/L représentant plus de 10% des globules blancs. C'est une maladie rare des sujets âgés (médiane 72 ans) avec une survie de 2 à 3 ans. Les 3 gènes les plus souvent mutés sont TET2 (60%), SRSF2 (50%) et ASXL1 (40%). Des mutations des gènes de la voie RAS (NRAS, KRAS, CBL), identifiées chez 30% des patients, sont associées aux formes prolifératives.Mon projet de thèse porte sur le rôle des suppresseurs de tumeurs TET2 et TP53 dans la LMMC. Dans cette pathologie, TET2 est fréquemment muté alors que les mutations de TP53 sont très rares. La première partie de ma thèse met en évidence une sur-expression de MIF (Macrophage migration inhibitory factor) dans les monocytes avec des mutations tronquantes de TET2 chez les patients LMMC. Nous avons montré dans différents modèles que MIF est sur-exprimé lorsque TET2 est moins exprimé. Des expériences de ChIP-PCR ont montré que TET2 se fixe directement au niveau du site d'initiation de la transcription (TSS) de MIF. Dans les monocytes avec des mutations tronquantes de TET2, une diminution du recrutement de HDAC1 et HDAC2 au niveau du promoteur de MIF a été identifiée. Cette modification de la structure chromatinienne favorise la transcription de MIF par l'intermédiaire du facteur de transcription EGR1 (Early Growth Response Protein 1). J'ai mis en évidence par co-immunoprécipitation une interaction entre EGR1 et TET2. Enfin, MIF est suffisant en soi pour induire un biais vers la différenciation monocytaire au cours de la différenciation granulomonocytaire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de sang de cordon. A l'opposé de TET2, TP53 est très peu muté dans la LMMC. L'expression du transcrit et de la protéine TP53 est très hétérogènes dans les monocytes des patients LMMC. J'ai mis en évidence un sous-groupe de patients avec une diminution de l'expression de TP53 et de la protéine correspondante. Les analyses de séquençage d'ARN (RNAseq) suggèrent que les patients présentant une expression réduite de TP53 sont plus enclins à évoluer vers une leucémie aiguë myéloïde (LAM). Les monocytes des patients atteints de LMMC exprimant faiblement TP53 ont également une diminution de l'expression de CSF1R, suggérant un défaut de maturation. Des expériences de sh-SCRB et sh-TP53 dans les CSH au cours de la monocytopoïèse en présence de CSF1 ont mis en évidence un blocage de différenciation à un stade pré-monocytaire quand TP53 est moins exprimé, démontrant un rôle de TP53 dans la maturation terminale des monocytes. Nous avons mis en place des analyses de cytométrie en flux pour étudier l'étape finale de maturation des monocytes, impliquant la molécule de surface CD300E. Nos données indiquent que les patients présentant une faible expression de TP53 ont une expression plus faible du marqueur CD300E à la surface des monocytes et sont plus immatures. Ce défaut de maturation terminale, lorsque TP53 est moins exprimé a également été validé à l'échelle unicellulaire. En recherchant les mécanismes impliqués dans la sous-expression de TP53, nous avons identifié une corrélation entre TP53 et EGR1 dans les monocytes de patients LMMC. La diminution de l'expression de EGR1 par des siARN diminue l'expression de TP53 dans les monocytes de patients. Enfin, en utilisant la cohorte DACOTA, nous avons mis en évidence que les patients exprimant faiblement TP53 avaient une moins bonne survie lorsqu'ils étaient traités par l'hydroxyurée.Mes travaux permettent de mettre en évidence un intérêt pour la stratification des patients et suggèrent des approches thérapeutiques pour restaurer l'expression de TP53 dans le clone leucémique pour réduire le risque de transformation de la maladie chronique en leucémie aiguë.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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